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大阪大学 IFReC   細胞動態学    前田 栄     2012/04/12

mCherryやCFPのselectionについて
がん細胞に蛍光タンパクを発現させて、生体イメージングに活用しようと思っています。

GFP、RFP, DsRed、Venusなどは、
通常のFACS Ariaでソートして、selectionでき安定株を作成してます。

Fucci2のmCherryや、FRETで使われるのCFPは、
通常のFACS Ariaで分離できなくて困っています。

どのようにselectionかけられているか教えていただけますと有り難いです。

どうぞよろしくお願い致します。
   
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1 京大生命科学研究科 生体制御  松田道行  幸長弘子 CFPのソーティング 2012/04/12
私は、CFPには470/30のフィルターを使用しています。
通常、405nmのViolet laserには450/40のフィルターがついているので、それと交換しています。
      
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2 理研・脳センター  宮脇敦史研究室  阪上ー沢野朝子 通常のFACS Aria とは? 2012/04/12
私はFACSの専門家ではないので教えていただきたいのですが、通常のFACS Aria とは、どのような状態を指すのでしょうか?

私が用いている脳センターのFACS Aria II には、励起レーザーとして、355nm, 405nm, 488nm, 532nm, 640nm と搭載されています。ですから、今一般的に用いられている蛍光タンパク質(Blue-, Cyan-, Green-, Orange-, Red- Fluorescent protein) はほぼソーティング可能です。

また、安定株を作製する方法として、
?single cell cloning (限外希釈法)
?FACSによるソーティング  
を平行しています。 目的によって使い分けます。 ?であれば、搭載レーザーの有無に左右されませんし・・・・・ 当ラボより配布している、Fucci及びFucci2発現細胞も?で得たクローンです。

他にも良い方法があれば、こういう場で話し合えればと思います。
沢野
      
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3 理研・脳センター  宮脇敦史研究室  阪上ー沢野朝子 ?になってますね、、、 2012/04/12
みなさま すみません。

確認画面までは大丈夫だったのですが、、、

(まるいち)single cell cloning (限外希釈法)
(まるに)FACSによるソーティング 

と書いたのですが、どちらの(まる)も?に化けてます。
その後の文章で採用しているのはいずれも(まるいち)です。

どうにも笑えます、、すみません。 沢野
      
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4 大阪大学 IFReC   細胞動態学  前田 栄 CFPのソート 2012/04/12
幸長先生
どうもありがとうございます。
今度、405励起でフィルターを交換してやってみます。
ありがとうございました。

ちなみに、CFPは細胞毒性があるといわれていますが、
蛍光強度がhighのものは、ソートするゲートから外しておられますでしょうか?
      
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5 大阪大学 IFReC   細胞動態学  前田 栄 455レーザー 2012/04/12
坂上先生

どうもありがとうございます。
selectionの方法として限界希釈法を忘れしてました。
なっとくです。

脳センターのARIAは、さすがフル装備ですね。
我々の施設ではmCherryやTomatoがソートできなくて、
先日455のレーザーを入れてもらいました。

まだ、試していませんが、これでソートできると伺っています。
どうもありがとうございました。
      
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6 京都大学 生命・生体制御学  松田道行研  幸長弘子 FACSAria 2012/04/12
前田さん
確かに、CFPの蛍光強度の高い細胞は弱いことが多いです。
蛍光強度の高いもの中くらいのものそれぞれ分取することもあります。

沢野さん
5本ものレーザーを搭載しているってすごいですね。
安定株を作製する方法として、FACSのソーティングとsingle cell cloningを合わせて使用しています。
      
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7 大阪大学 IFReC   細胞動態学  前田栄 FRETのソート 2012/04/12
幸長先生

もう1つ教えていただきたいです。

FRETプローブの入った安定株をとるときは、
CFPでソートしていますか?
それとも、YFPですか?
どちらでもいいような気がしますが。。。。
どのようにされているか知りたいです。

よろしくお願いします。
      
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8 京都大学 生命・生体制御学  松田道行研  幸長 ソーティング 2012/04/12
前田さん

CFPとYFPで展開しています。
どちらも均等に発現している細胞のみを分取しています。
      
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